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注意事项

1. 一抗采用叠氮纳作为抗体保护剂，浓度低于0.1%，在使用时避免试剂接触眼睛或粘膜，如果不慎接触，立即用大量的水冲洗；

2. 在处理可疑致癌物质或 有毒物质时请佩戴一次性手套；

3. 避免微生物感染试剂；

4. 工作液试剂已经经过最优稀释，更多的稀释可能导致不显色。

二步法（以iVision和PowerVision试剂盒为例）

1．石蜡切片脱蜡和水化后用PBS（PH7.4）冲洗，3分钟×3次。

2．根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复处理。

3．3％H202（现配现用）孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

4．PBS冲洗，3分钟×3次；甩去PBS液，滴加适当比例稀释的一抗或即用型的一抗工作液，湿盒中室温下孵育60分钟或4℃过夜。

5．PBS冲洗，5分钟×3次；甩去PBS液，滴加二抗、辣根过氧化物酶多聚体溶液（剂盒提供），室温孵育10～30分钟。

6．PBS冲洗，3分钟×3次；甩去PBS夜，，滴加显色剂（DAB或AEC）显色；显色时间为5～10分钟，可在显微镜下观察显色情况。

7．自来水冲洗；苏木素复染，0.1％盐酸酒精分化，0.1％氨水或PBS冲洗返蓝。

8．如果DAB显色，则切片梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片；如果AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水溶性封片剂封片。

三步法（以SP法为例）

1．石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH7．4）冲洗，3分钟×3次。

2．根据每一种抗体的要求；对组织抗原进行相应的修复处理。

3．3％H202（现配现用）孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

4．PBS中先；3分钟×3次；甩去PBS液5％～10％的非免疫物血清封闭，室温孵育10分钟，勿洗。

5．甩去血清，滴加适当比例稀释的一抗或即用型的一抗工作液，湿盒中室温下孵育60分钟或4℃过夜。

6．PBS冲洗，5分钟×3次；甩去PBS液，滴加生物素标记的二抗，室温下孵育10分钟。

7，PBS冲洗，3分钟×3次；甩去PBS液，適加辣根过氧化物酶标记链霉菌抗生物素蛋白，室温下孵育10分钟。

8．PBS冲洗。3分钟×3次；甩去PBS液，滴加显色剂（DAB或AEC）显色；显色时间为5～10分钟，可在显微镜下观察显色情况。

9．自来水冲先，苏木素复染，0.1％盐酸酒精分化，0.1％氨水或PBS冲洗返蓝。

10．如果DAB显色，则切片梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片；如果AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。

注意：如果组织内源性生物素含里较高，必须在滴加抗体前用适当浓度的卵白素溶液对组织内源性生物素进行封闭处理，以避免岀现假阳性结果。